CRISPR sgRNA 文庫服務

服務簡介

          CRISPR-Cas9 技術作為最被廣泛接受的基因編輯工具，具有精準、廉價、易于使用的特點。 由于基因組序列中PAM序列的廣泛存在，運用CRISPR-Cas9技術基本能實現對基因組中所有基因的編輯。CRISPR文庫基于CRISPR/Cas9技術建立高通量基因篩選方案，通過微陣列技術合成高質量寡核苷酸序列，高通量的構建sgRNA質粒文庫，包裝慢病毒后以低MOI（通常＜0.3）感染待篩選細胞，確保一個細胞只進入一種sgRNA，再給細胞加以篩選因素（如藥物處理、低氧處理、病毒感染或細胞本身的生存能力等），收集篩選后不同時間段（0 day/7day/14day）的細胞進行NGS測序，正向篩選或負向篩選分析實驗組與對照組之間sgRNA的豐度變化情況，獲得與篩選因素相關的靶基因。艾基生物整合多個技術平臺，可提供CRISPR sgRNA文庫的一站式合成及基因功能篩選服務，包括快速高效地實現sgRNA oligo pool合成及文庫構建，質粒制備，病毒包裝，細胞轉染、NGS測序和數據分析。

服務流程 

服務優勢

1、豐富的基因合成和建庫經驗，確保文庫的多態性和均一性, 文庫可達10⁸。

2、根據客戶自身需求選擇sgRNA表達載體，并提供轉染級質粒。

3、提供從sgRNA設計、文庫構建到慢病毒包裝的一站式服務。

應用案例

維莫非尼 (vemurafenib,PLX) 是一種用于治療BRAF V600突變陽性的不可切除或轉移性黑色素瘤的藥物，癌細胞產生的突變可以對該藥物產生抗性?？茖W家試圖找到導致黑色素瘤中對BRAF蛋白激酶抑制劑維莫非尼（PLX）產生耐藥性的基因靶點，以A375細胞為模型，應用GeCKO正向選擇，確定發生敲除的導致抗藥性的基因，并針對新靶點開發藥物。

A：A375黑色素瘤細胞PLX耐藥篩查時間線 

B：暴露于PLX的條件下，導致轉導的A375細胞生長停滯，這些細胞攜帶V600E功能獲得BRAF突變

因此能夠富集一小群通過Cas9/sgRNA介導的編輯而變得耐藥的細胞。Vehicle是對照組

PLX處理14天后，與對照處理的細胞相比，sgRNA分布顯著不同（Wilcoxon秩和檢驗，P < 10?10），并且與所有其他條件分開聚集。

作者發現一個小的基因集，在PLX處理14天后，靶向每個基因的多個sgRNA富集，這表明這些特定基因的丟失有助于A375細胞獲得PLX抗性。

示例圖

Shalem Ophir,Sanjana Neville E,Hartenian Ella et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.[J] .Science, 2014, 343: 84-87.

參考文獻

[1] Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelson T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F. 

Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. 

Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-87. doi: 10.1126/science.1247005. Epub 2013 Dec 12. PMID: 24336571; PMCID: PMC4089965.

[2] Wang Y, Gao B, Tan PY, Handoko YA, Sekar K, Deivasigamani A, Seshachalam VP, OuYang HY, Shi M, Xie C, Goh BKP, Ooi LL, Man Hui K. 

Genome-wide CRISPR knockout screens identify NCAPG as an essential oncogene for hepatocellular carcinoma tumor growth. 

FASEB J. 2019 Aug;33(8):8759-8770. doi: 10.1096/fj.201802213RR. Epub 2019 Apr 25. PMID: 31022357; PMCID: PMC6662966.

[3] Kiessling M K, Schuierer S, Stertz S, et al. 

Identification of oncogenic driver mutations by genome-wide CRISPR-Cas9 dropout screening[J]. 

BMC genomics, 2016, 17(1): 1-16.

[4] Sasaki M, Ogiwara H. 

Synthetic lethal therapy based on targeting the vulnerability of SWI/SNF chromatin remodeling complex‐deficient cancers[J]. 

Cancer Science, 2020, 111(3): 774-782.

[5] Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, Bojorquez-Gomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN, Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, Ideker T, Mali P. 

Combinatorial CRISPR-Cas9 screens for de novo mapping of genetic interactions. 

Nat Methods. 2017 Jun;14(6):573-576. doi: 10.1038/nmeth.4225. Epub 2017 Mar 20. PMID: 28319113; PMCID: PMC5449203.

[6] Feng X, Tang M, Dede M, et al. 

Genome-wide CRISPR screens using isogenic cells reveal vulnerabilities conferred by loss of tumor suppressors[J]. 

Science advances, 2022, 8(19): eabm6638.

[7] Zhang R, Miner JJ, Gorman MJ, Rausch K, Ramage H, White JP, Zuiani A, Zhang P, Fernandez E, Zhang Q, Dowd KA, Pierson TC, Cherry S, Diamond MS. 

A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. 

Nature. 2016 Jul 7;535(7610):164-8. doi: 10.1038/nature18625. Epub 2016 Jun 17. PMID: 27383988; PMCID: PMC4945490.

[8] Ma H, Dang Y, Wu Y, Jia G, Anaya E, Zhang J, Abraham S, Choi JG, Shi G, Qi L, Manjunath N, Wu H. 

A CRISPR-Based Screen Identifies Genes Essential for West-Nile-Virus-Induced Cell Death. 

Cell Rep. 2015 Jul 28;12(4):673-83. doi: 10.1016/j.celrep.2015.06.049. Epub 2015 Jul 16. PMID: 26190106; PMCID: PMC4559080.