pLVX-LexA-EGFP-CD63 病毒

產品簡介

          pLVX-LexA-EGFP-CD63，即Lentivirus expressing EGFP-CD63 fusion protein，是艾基自行研發的一種可以在大多數哺乳動物細胞(包括原代細胞和干細胞)中通過CMV啟動子表達人源CD63-EGFP融合蛋白的重組慢病毒。本產品可用于外泌體的示蹤研究，用于研究外泌體的形成、分泌、靶向和運輸機制。本產品帶有嘌呤霉素 (Puromycin)抗性基因，感染細胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩定株。

          外泌體(Exosome)是膜包裹的細胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直徑約為40-160nm，具有脂質雙分子層結構，天然存在于血液、尿液、腦脊液，以及體外培養細胞的上清液中[1]，幾乎所有類型的細胞都可以產生并釋放外泌體[2]。如圖1所示，細胞膜內吞(Endocytosis)依次形成初級內體 (Early sorting endosome ESE)、次級內體(Late sorting endosome , LSE) 和多囊泡體(Multivesicular body, MVB) ，其中多囊泡體包含腔內囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs) 。多囊泡體與細胞膜融合形成外泌體，外泌體攜帶多種來自其母體細胞的成分(包括核酸、蛋白質、脂類和代謝物等)釋放到胞外基質中[3]。外泌體可以被附近或遠距離的細胞識別和融合，是細胞間進行相互調控的重要媒介，參與了癌癥、神經退行性病變和炎癥性疾病等多種疾病的發病過程，影響細胞多方面的的功能[4-5]。

圖1. 外泌體的形成原理及其攜帶的母體細胞成分示意圖。

          外泌體標志蛋白（Protein biomarkers for exosome），也稱外泌體蛋白標志物（Protein markers for exosome），可以用于鑒定、觀察、標記和純化外泌體。據外泌體庫 ExoCarta（http://www.exocarta.org）統計，來自不同生物、細胞類型和體液的外泌體中已發現 9769 種蛋白質，ExoCarta 列出了 100 種常見外泌體蛋白標志物（http://exocarta.org/exosome_markers_new），其中 CD9、CD63、CD81、ALIX、Flotillin、Ceramidase 和 TSG101 是最常用的外泌體蛋白標志物（如圖 2 所示）。CD63 在人體中由 CD63 基因編碼的蛋白質抗原，是跨膜四超家族（Transmembrane 4 superfamily）成員之一，為中次跨膜蛋白 [1]，大量存在于細胞外囊泡的表面，也會出現在普通的細胞膜表面。CD63 是最常用的外泌體蛋白標志物之一，被認為是調控細胞外囊泡產生和胞內物質分選的關鍵因子 [6] 。

圖2. 常見的外泌體蛋白標志物示意圖。

? pLVX-LexA-EGFP-CD63感染HEK293T細胞后的表達效果如圖3所示

TU                                                          1×10^5                                                          1×10^6

圖 3. 艾基生產的pLVX-LexA-EGFP-CD63感染HEK293T細胞的效果圖. 24孔板每孔100,000個細胞，

培養過夜后用相應的病毒TU數進行感染，病毒感染72小時后熒光顯微鏡實拍相同大小視野效果圖。

實際檢測效果會因檢測儀器、實驗條件的不同而存在差異，本圖僅供參考。

          慢病毒感染細胞后會將目的基因隨機整合到基因組 DNA 上，因而可以長期穩定地表達目的蛋白，并且幾乎可以感染所有哺乳動物細胞，在很多不分裂的細胞中也可以長期穩定表達，廣泛應用于細胞和動物實驗。

          本產品表達慢病毒抗性基因，因此本產品感染培養的細胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩定表達的細胞株以用于后續研究。

          艾基的 pLVX-LexA-EGFP-CD63是復制缺陷慢病毒。其 3’ LTR 的增強子功能發生缺失，形成了自失活（self - inactivating）3’ LTR，并且 5’ LTR 中的 U3 區域替換成 CMV 啟動子，在感染普通的細胞后不能進行復制和擴增，從而有效降低了本產品在活體生物中的風險。

包裝清單

保存條件

        -80oC保存，一年有效。-20oC保存，兩周內有效。4℃保存，3天內有效。

注意事項

1. 收到病毒液后，如短期內需馬上使用，請以 4°C保存(在 4°C保存條件下，病毒液請于一周內用完)；如需長期保存，則可分裝后存放于-80°C 。一般病毒可存放于-80°C約 6~ 12個月(病毒置于凍存管，并使用封口膜封口) ，如保存 6個月后使用，請重新檢測病毒滴度。

2. 使用前，請將病毒置于冰?。ɑ?/span> 4°C)中解凍。操作全程需將病毒置于冰盒中，保證低溫以穩定其活性。

3. 我司提供的病毒以每管100μl，滴度在10⁸TU/mL以上進行定量分裝，老師可根據實驗加入不同的量使用。病毒凍融后可以按照實際使用情況進行再次分裝，但一次凍融病毒滴度損失可能達 10 - 20%。分裝后的病毒也應于-80°C乃至液氮保存。

4. 慢病毒的稀釋：用戶需要稀釋病毒時，請將病毒取出置于4度融化后，使用1x PBS 或無血清的細胞基礎培養基混勻稀釋至合適滴度后進行細胞感染實驗，稀釋后的病毒在4°C保存條件下，三天內需要用完（不建議進行分裝凍存）。

注意：應避免反復循環凍融慢病毒，這會導致病毒滴度大幅下降。

安全須知

        IGE 的慢病毒都是“ 自我失活”的，因為我們已從病毒基因組中刪除了負責復制的基因，這也就意味著它們不能在靶細胞內復制并感染其他細胞。病毒仍然可以在理論上造成潛在的生物危害風險，因為它可以感染人類原代細胞，故我們強烈建議依照生物安全2級（BSL2級）標準要求處理病毒，生物危險廢物貯存和處理方案必須與公布的標準相一致。

靶細胞感染方法

        我們建議您使用表達GFP的對照慢病毒來確定靶細胞的最佳感染復數（MOI）。MOI（Multiplicity of Infection，感染復數）是通常指每個細胞感染的最大病毒數；不同種類或不同來源的細胞，其最適MOI 各有差別。

        常見細胞MOI和感染條件可以參照附件1《常見細胞MOI和感染條件》內容，但由于不同實驗室培養的細胞存在狀態和培養條件的差異，第一次使用慢病毒時，建議先用對照慢病毒進行感染預實驗，確定細胞最佳感染條件及MOI。

注意：

MOI值的計算：MOI值=加入病毒總數/細胞總數，如一個培養孔中細胞數為1×105個，加入 1×106TU的病毒時，侵染實驗中MOI為10。

1、病毒感染貼壁細胞的實驗（以12孔板為例）

實驗前按照不同的MOI值設置不同的感染孔，并根據MOI值和細胞數量計算所需要的病毒量，如有必 要可以使用PBS溶液或者無血清培養基稀釋病毒原液。

1.1 感染前一天（第 0 天）

將靶細胞進行傳代鋪板，使其在感染時達到 30-50％的匯合。鋪板后將細胞置于37°C， 5% CO2 培養箱中孵育 18-20小時。例如，當使用293T細胞時，我們通常在 12 孔板中每孔接種 1.5× 105 個細胞。

1.2 感染當天（第 1 天）

將病毒從-80°C冰箱取出置于冰上解凍。根據所需的 MOI 取適量的病毒置于適量的培養基中，輕輕混勻（但不要渦旋）。為了最大限度地提高感染效率，可使用覆蓋板表面所需的最少量培養基。例如，當在12 孔板中進行感染時，我們每孔使用 0.5ml 培養基。

注意：如果細胞容易被感染，開始以 MOI為1 到10 之間感染細胞。對于某些細胞系，可能需要更高的 MOI。

a. 從靶細胞中棄去舊培養基，然后將含有病毒的培養基加入細胞中。

b. 輕輕旋轉平板，在 37°C ，5％CO2 培養箱中孵育4-6小時。

注意：感染前細胞的狀態好壞對最終的感染效率高低影響很大，所以務必保證加病毒之前細胞處于良好的生長狀態。慢病毒對目的細胞的感染效率較低時，通過提高MOI 值可以增加病毒的感染效率，但必須注意細胞的生長狀態是否受到影響。

很多細胞在培養基中加入終濃度為5-10 μg/ml的Polybrene可以提高病毒的感染效率。Polybrene可以增強慢病毒的轉染作用。Polybrene 是帶正電的小分子，可以細胞表面的負電荷相互作用以增加病毒衣殼和細胞膜之間的結合。Polybrene 可能對某些細胞有害。您可能需要首先測試細胞對Polybrene 的敏感性，濃度為1-10μg/ml。對于大多數細胞類型，建議使用5μg/ml。

注意：過量接觸 Polybrene（＞12 小時）可能對某些細胞有毒害性。

c. 孵育4-6小時后，吸去含病毒的培養液：用正常培養液或PBS小心洗細胞2-3遍，最后加入合適體積的培養液過夜。

1.3 感染第3天

從第3天開始，每天觀察細胞，如載體帶有熒光，則注意觀察熒光，并關注細胞生長狀態，如有必要進行換液，以保證細胞良好的生長狀態。對于相關基因的檢測可采用Real-time PCR或WesternBlot；也可加入含有抗生素的培養基進行藥物篩選，每 2-3 天更換含有抗生素的新鮮培養基。

注意：具有強代謝能力的細胞如293T 和BHK21細胞系，在轉染后24 小時則可表達熒光。然而，對于代謝緩慢的細胞如原代細胞、NSC 、MSC 等，GFP或mcherry等熒光的表達需要更長時間，因此可能在轉染后 72-96 小時才觀察到熒光。所以在此期間應及時更換培養基和傳代細胞，確保細胞健康生長。