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服務介紹  Service Introduction




        DNA 甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分,在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著 重要的作用。Bisulfite 處理能夠將基因組中未甲基化的胞嘧啶與甲基化的胞嘧啶區分開來,因此成為表觀遺傳學研究的經典實驗方法。 Bisulfite 處理與高通量測序技術相結合的測序方法—Bisulfite Sequencing 能夠繪制單堿基分辨率的 DNA 甲基化圖譜。特定物種的高精 確度甲基化修飾模式的分析,為廣泛應用于細胞分化、組織發育等基礎機制研究,以及動植物育種、人類健康與疾病研究奠定基礎。

       隨著分子生物學的快速發展,研究表觀遺傳學的技術也在不斷產生,主要有以下四種:全基因組甲基化測序(Bisulfite 測序)、簡化基因組甲基化測序(RRBS 測序)、免疫共沉降測序(ChIP-seq)、甲基化抗體沉降測序(MeIDP-seq)。上述四種方法都是研究 DNA 甲基化的常用方法,其不同點在于對前期 DNA 的處理方式不同,以全基因組甲基化測序為例,其采用亞硫酸氫鹽處理基因組 DNA 使未 甲基化修飾的胞嘧啶 C 堿基轉化成尿嘧啶 U,通過對處理后的 DNA 進行全基因組重測序,從而對整個染色體、基因的不同功能區域以及 基因組中重復元件的甲基化進行分析,從基因水平實現單堿基的甲基化水平分析。從基因組水平實現單堿基的甲基化水平分析。雖然該方 法全面詳細的分析了甲基化水平,但測序成本相對昂貴,因此產生了簡化甲基化測序,該方法主要是采用甲基化不敏感的 II 型限制性內切 酶進行完全酶切,然后富集特定大小的基因組片段,利用高通量測序平臺進行測序分析。

 

技術流程 Technical Procedures




       圖片15

 

樣品要求及實驗周期




表觀遺傳學相關DNA測序樣品要求及周期

實驗類型

樣品總量

樣品濃度

樣品純度OD260/280

樣品保存

實驗周期

全基因甲基化測序

3 μg 的基因組 DNA

基因組 DNA 樣品濃度 >100 ng/μl,富集后 DNA 樣品濃度 >5 ng/μl,

OD260/280 介于 1.8-2.0 之間,無肉眼可見污染;

請選擇乙醇、純水進行保存

40-60個工作日

簡化基因組甲基化測序

≥4 μg  DNA

40-60個工作日

免疫共沉降測序

30 ng 的抗體富集后的 DNA 片段樣品

40-50個工作日

甲基化抗體沉降測序

30 ng 的抗體富集后的 DNA 片段樣品

40-45個工作日

 

 

生物信息學分析Bioinformatics Analysis




生物信息學分析

全基因組甲基化測序分析內容

簡化基因組甲基化測序分析內容

ChIP-seq 測序分析內容

MeIDP-seq 測序分析內容

數據產出總量、C 的測序深度統計、基因組覆蓋度統計 

數據產出統計及基本的數據質控處理

數據產出統計及基本的數據質控處理

原始數據產出統計及基本的數據質控處理 

與目的物種基因組進行比對

測序數據與目的物種基因組進行比對

通過參考基因組比對確定 Peak 的位置信息

與基因組比對(需要客戶提供參考基因組信息) 

鑒定 C 堿基的甲基化狀態及在基因組上的分布

胞嘧啶 C 的測序深度統計

Peak 的數量及長度,以及富集度統計

基因組上檢測到的甲基化區域統計 

統計各染色體所有 5mC 的數量、位置及甲基化水平

Promoter 和 CpG 島上覆蓋度及甲基化分析

基因組上不用功能區域 Peak 分布統計

每個樣品檢測到的甲基化區域的分布情況(在重復區域、基因區、基因間區的分布) 

統計各同基因功能區域內 5mC 中 CpG、CHG、CHH 所占的比例及甲基化水平 

鑒定胞嘧啶 C 堿基的甲基化狀態及在基因組上的分布

多個樣品間 Peak 及相關基因的差異分析

提供與樣本甲基化區域相關的基因列表

CpG、CHG、CHH 中 5mC 附近的 6 bp 序列的特征分析 


Peak 相關基因 GO 顯著性富集分析

兩個樣本間甲基化區域相關差異統計

 多樣品間的差異性甲基化區域(DMR)預測


2 個以上樣本差異分析


 


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