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技術支持

致力于引進國外先進技術,為廣大科研工作者和醫療機構提供高質量 的科研技術支持 。

常見問題解答

基因合成

Q:

質粒上有兩個polyA序列,一個是BGHpA,一個是SV40pA,這兩個有什么區別?

A:

BGHpA是牛生長因子polyA(BGH聚腺苷酸化信號序列):可以有效終止轉錄和mRNA聚腺苷酸化的牛生長因子(BGH)聚腺苷酸化信號序列,多聚腺苷酸尾(或聚A尾)保護mRNA,免受核酸外切酶攻擊,并且對轉錄終結、將mRNA從細胞核輸出及進行翻譯。而SV40pA是猴空泡病毒polyA(SV40早期poly-A信號序列)以及SV40晚期poly (A)序列。SV40 PolyA(猴空泡病毒PolyA,簡稱PolyA)序列是有轉錄終止作用和使轉錄的mRNA添加PolyA尾的DNA序列(240 bp),含有AATAAA六核苷酸多腺苷化信

Q:

我想用真核細胞表達我的基因片段,假如我的基因片段插在多克隆位點上,但是多克隆位點與真核啟動子之間隔了一個原核的T7啟動子,就是我的目的基因與啟動子之間隔了一個原核的啟動子,這樣我的基因還能表達嗎?

A:

某些真核表達載體上同時存在CMV啟動子和T7啟動子例如:在pcDNA3.1/myc-His系列載體中CMV啟動子位于209~863,而T7啟動子則位于863~882,這樣目的基因就可以在含有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌表達。在宿主細菌細胞或體外轉錄中,質粒DNA可以利用T7啟動子驅動基因表達,而在哺乳動物細胞中,轉基因表達由CMV啟動子驅動。而T7 啟動子在這個商業化載體pCDNA3.1(+)中常被用于測序。所以,若是使用真核載體pCDNA3.1(+)或者pCDNA3.1(-)的話,一般情況下是不會影響基因的表達。

Q:

請問你們的細菌有T7 polymerase可以直接在該細菌上表達克隆基因的嗎?

A:

具有T7 polymerase的表達菌株,本司常備有BL21(DE3)和BL21(pLysS)兩種表達菌株: BL21(DE3):表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體(如pET系列)的非毒性基因。 BL21(pLysS):pLysS含有表達T7溶菌酶的基因,適合表達毒性蛋白和非毒性蛋白。

Q:

密碼子優化過的基因,艾基生物是否還提供蛋白表達服務?

A:

艾基生物同時可為合成的基因提供蛋白表達及純化服務。艾基生物提供四大蛋白表達系統:原核蛋白表達系統、酵母蛋白表達系統、桿狀病毒-昆蟲細胞蛋白表達系統及哺乳動物細胞蛋白表達系統。若需要訂購蛋白表達服務,會有相關業務員跟進關于蛋白純白條件摸索以及蛋白純化等等工作以及報價。

Q:

艾基生物是否免費提供自備載體驗證服務?

A:

在艾基生物訂購質粒構建服務,可為您免費提供一個反應(正常情況下可測序驗證插入的MCS區域)的載體測序驗證服務。若測序驗證由于您提供的樣品或樣品信息出現問題時,需要加測反應,則有您承擔加測費用。

Q:

提供的質粒量太少了,能不能多提供一些?

A:

客戶在下訂單的時候可以自行標注多所需要發貨量,我們盡量滿足合理范圍內所有要求

Q:

如何使用艾基生物基因合成或克隆構建交付的項目樣品,交付的項目樣品類型都有哪些?

A:

如您在艾基生物訂購基因合成、克隆構建、定點突變等質粒構建的項目,將會為您提供經測序驗證的質粒1-2ug,含重組質粒的新鮮菌液和甘油菌。 A. 質粒· 樣品形式為液體,含有少量的Tris-Hcl,不影響測序和酶切。一般高拷貝載體濃度在100-250ng/μl,而低拷貝載體濃度在50-100ng/μl,具體見標簽上注明的濃度,提供總量約1~2ug?!?使用方法:可以直接進行酶切和測序,也可進行轉化(用量為0.5 ul~1 ul)?!?保存:建議-70℃長期保存。B. 新鮮菌液· 樣品形式為新鮮菌液(不含甘油),可接種于新鮮的培養液中37℃過夜培養后直接提取質粒。· 菌株為Match-T1,JM109,DH10B,該菌株為非甲基化缺陷型菌株,使用限制性內切酶處理樣品時,…

Q:

基因合成服務提供的數據報告包含哪些文件,每個文件需要使用什么軟件打開?

A:

您所收到的基因合成服務數據報告是ZIP格式的壓縮文件,可以使用Winrar(4.0以上版本)打開,數據報告一般含有7類文件,包含測序原始圖譜、序列比對文件和質粒圖譜及序列。分別為: 1. *.abl 文件為 ABI 3730 序列圖譜,是測序結果的峰圖文件,可使用 Chromas 或其它相關軟件查看。 Chromas 軟件可在以下地址免費下載: http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html 2. *.seq 文件為*.abl 峰圖文件對應的序列文件,可以使用 TXT 文檔等相關軟件打開。 3. *.cm5 文件為您的質粒圖譜,該文件必須使用 Clone Manager 5 及以上版本查看及編輯。 4. 如果您無法使用 Clone Manager,我們為您提供了一個*.gbk 文件,該文件為 genbank 格式…

Q:

在大腸桿菌表達系統中,哪種終止密碼子具有偏好性?在哺乳動物系統中呢?

A:

在大腸桿菌中,TAG很少用;經常使用的是TAA;TGA也可以。在哺乳動物中,TGA的使用頻率高于TAA和TAG。相對于哺乳動物和大腸桿菌之間的不同,密碼子使用表在哺乳動物不同有機體間的區別不是很大。

Q:

如想在兩種不同的宿主中表達目的蛋白,艾基生物是否能夠在兩種宿主中進行優化?

A:

可以。我們的優化工具可以幫助您同時針對兩個不同宿主物種進行基因優化。該工具可同時載入兩個宿主的密碼子偏向性和順勢作用元件等優化參數,雙宿主優化算法會搜尋兩個宿主表達的平衡點,以求在兩個宿主中都可以得到令人滿意的蛋白表達量。但是在兩個宿主物種的親緣關系比較遠等情況下,雙宿主基因優化則很有可能在兩個宿主中都得不到理想的優化結果。如果您在您的雙宿主優化結果中發現了CAI小于0.80,大量順勢作用元件沒有被過濾掉,或其他可能影響基因表達的現象,我們推薦您針對兩個宿主分別使用我們的單一宿主優化方法。

Q:

如需基因優化,我需要提供哪些信息?

A:

若需基因優化,我們需要您提供如下信息:a.被優化的基因序列或者蛋白序列;b.優化的宿主(物種,例如:人、小鼠、茄子等等);c.基因兩端需添加的酶切位點或者基因內部需避免的酶切位點;d.是否需要特定的終止密碼子;e.是否需添加Kozak序列,對于哺乳動物表達系統我們一般建議您添加Kozak序列。

Q:

密碼子優化有必要嗎?

A:

對于用于蛋白表達的基因來說,多數情況下是有必要的。如真核生物的基因需要在原核生物中表達。由于真核生物的密碼子偏好和原核生物有很大不同,對基因進行密碼子優化將顯著提高表達效率。

Q:

構建后的質粒以及項目相關信息,艾基生物會保留嗎?會保留多久?

A:

您的實驗數據、質粒及甘油菌艾基生物將為您保存1個月,請您拿到樣品后盡快驗證實驗結果。

Q:

訂購定點突變項目,需要提供什么信息?為什么突變一個點,收費會比目錄價更貴?

A:

需提供改造前載體的相關信息(質粒圖譜、全序列、多克隆位點、克隆位點上下游50 bp序列的驗證結果),并注明突變的氨基酸序列以及突變位點。若突變的序列較長或無適合的酶切位點,會按照克隆長度進行分析報價,相對而已收費比目錄價更貴一些。

Q:

訂購克隆構建項目,需要提供什么信息?

A:

需要您明確告知克隆要求,并確保提供信息的正確性。需提供改造前載體的相關信息(質粒圖譜、全序列、多克隆位點、克隆位點上下游50 bp序列的驗證結果),并注明使用時是否有特殊要求;模板相關信息(模板類型、模板序列、模板驗證結果);構建后的質粒信息(構建后質粒命名、構建后質粒序列)

Q:

艾基生物可以將合成的基因克隆至我指定的載體嗎?

A:

可以。但如非艾基生物常備的其它的載體需要由客戶自己提供。如果您需要將合成的基因克隆到您指定的載體上,需要您提供載體相關信息(質粒圖譜、全序列、多克隆位點、克隆位點上下游50bp序列的驗證結果),若無法提供測序結果,我司會提供測序驗證的服務,我們會根據目的基因的長度,載體構建的難度加收部分亞克隆費用(除部分免克隆費的載體)。

Q:

pGSI載體和其他免費克隆載體什么區別?在什么情況下,艾基生物建議使用pGSI載體?

A:

艾基生物基因合成服務為客戶免費提供pGSI,pBluescript II SK(-),pUC19,pUC57,pcDNA3.1(+) 5種克隆載體。pGSI是由pBluescript II SK改造過的, 除去了它的多酶切克隆位點,只保留SmaI、EcoRV、XhoI 3種克隆位點。如客戶對克隆載體和克隆位點沒有特殊要求,我們將會默認把目的基因片段平端克隆到pGSI的SmaI位點。如果客戶要求避免一些載體上常用的酶切位點以方便后續的亞克隆需求,我們可保證構建后的質粒上不出現指定的酶切位點。

Q:

艾基生物能合成多長的基因?

A:

沒有長度限制,艾基生物可為您合成長達10 kb及以上的基因序列。且艾基生物已挑戰合成成功的基因有:長達30 kb的基因(分段組裝);>90%高GC含量或<10%高AT含量的基因;重復片段基因;強二聚體結構的基因;含50多個連續腺嘌呤的基因 (aaaaaaa……)等幾千種復雜基因。

Q:

艾基生物基因合成服務的優勢有哪些?

A:

艾基生物基因合成服務主要競爭優勢:①基因合成平臺:可以合成任何基因,包括高度重復(正向/反向)序列、AT/GC rich 序列、發夾結構、連續單一堿基重復等富含特殊結構的復雜基因、毒性基因等②特殊的克隆策略:采用無縫隙克隆組裝技術,可將合成的基因插入到任意載體的任一位置。③客戶信息安全保證:艾基生物基因合成周期短,特有的安全制度保證客戶的信息安全,公司嚴格按照與客戶簽定的基因合成服務協議和保密合同執行服務;④良好的客戶信任度:服務質量可靠,提供DNA測序結果,保證所合成的基因序列100%準確。艾基生物為客戶合成的許多基因以及提供的密碼子優化后序列合成,在其發表的高水平文章中得到引用。

Q:

與傳統PCR克隆相比,基因合成有什么優點?

A:

基因合成有如下優點:①專業的密碼子優化技術提高了蛋白的表達量及可溶性;②成本效益低,通過普通PCR克隆方法構建組織特異性cDNA文庫是費時費錢的;③基因合成獲得的基因無突變、準確,普通PCR產生非預期結果的可能性大,從而影響后續實驗的進行;④不需要依賴模板以及載體酶切位點的限制。

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